常規(guī)質(zhì)?；虮磉_(dá)載體系統(tǒng)利用LoxP-Stop-LoxP（LSL）表達(dá)盒，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)Cre介導(dǎo)的條件性基因激活表達(dá)。LSL表達(dá)盒包含三個(gè)重復(fù)的SV40 polyA，序列兩端為L(zhǎng)oxP位點(diǎn)。用戶選擇的啟動(dòng)子位于LSL表達(dá)盒的上游，而用戶感興趣的基因位于其下游。在Cre重組酶不存在的情況下，該表達(dá)盒完全阻斷了目的基因的正常表達(dá)；當(dāng)將Cre引入攜帶該載體的細(xì)胞中時(shí)，目的基因上游的LSL表達(dá)盒將會(huì)被刪除，從而目的基因能夠在用戶選擇的啟動(dòng)子下被永久激活表達(dá)。

該載體不僅適用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，更適用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建。當(dāng)攜帶這種載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與攜帶組織特異性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交時(shí)，產(chǎn)生的動(dòng)物后代將在特定的細(xì)胞中組織特異性表達(dá)Cre，從而啟動(dòng)目的基因在該特定細(xì)胞中組織特異性表達(dá)。

在細(xì)胞培養(yǎng)中使用該載體系統(tǒng)時(shí)，可將抗生素或熒光標(biāo)記添加到載體中，使轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可被篩選或可示蹤以便于分離出已永久整合載體的細(xì)胞。

關(guān)于該載體系統(tǒng)和Cre介導(dǎo)重組的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

該載體是為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)Cre介導(dǎo)的條件性基因表達(dá)而設(shè)計(jì)的。目的基因的表達(dá)最初是沉默的，但通過與Cre重組酶的共表達(dá)后，目的基因上游的3x SV40 pA將會(huì)刪除，從而目的基因能夠在用戶選擇的啟動(dòng)子下被永久激活表達(dá)。

基因的穩(wěn)定激活：經(jīng)過Cre重組酶處理后，阻斷下游基因轉(zhuǎn)錄的3x SV40 pA將被永久刪除，隨后客戶選擇的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)的目的基因的正常表達(dá)。

技術(shù)簡(jiǎn)單：常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過程更簡(jiǎn)單。

載體容量非常大：我們的載體總?cè)萘靠蛇_(dá)30 kb，其中質(zhì)粒骨架只占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達(dá)：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞多達(dá)幾千拷貝），使外源基因能高水平表達(dá)。

適用于體內(nèi)應(yīng)用：該載體不僅擁有良好的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，更適用于體內(nèi)活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如Cre介導(dǎo)的條件性基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

載體DNA非整合型：常規(guī)質(zhì)粒在細(xì)胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也稱為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。然而，質(zhì)粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染每10²~10⁶個(gè)細(xì)胞可能會(huì)有一個(gè)細(xì)胞的基因組被整合，整合效率取決于細(xì)胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，在經(jīng)過擴(kuò)大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細(xì)胞分選來獲得穩(wěn)定整合了該載體的細(xì)胞。

可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型受限：不同類型細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異很大。非分裂細(xì)胞比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。一些重要的細(xì)胞類型更是難以轉(zhuǎn)染，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，很少運(yùn)用到活體實(shí)驗(yàn)。

基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個(gè)細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒有。而病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)更傾向于相對(duì)均勻地把基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中。

Promoter: The promoter that will drive expression of your gene of interest after treatment with Cre recombinase.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. When Cre is present the region flanked by the two LoxP sites will be excised.

3x SV40 pA: Three repeats of the simian virus 40 late polyadenylation signal. This terminates transcription from the upstream promoter, preventing expression of the downstream gene of interest.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.